Identifizierung und Charakterisierung des HSP70 Makronukleus-Gens aus Euplotes crassus (German Edition)

Diplomarbeit, die am 01.05.1998 erfolgreich an einer Universität in Deutschland eingereicht wurde. Zusammenfassung: Bei dem hypotrichen Ciliaten E.crassus wurde das Makronukleus-Chromosom, welches das HSP7O-Gen trägt, identifiziert. Für die Identifikation eines internen Gen-Fragmentes wurde die Methode der heterologen PCR angewendet. Die 5'- und 3'-Enden des Gens konnten mit einem telomerspezifischen Primer und mit homologen Primern, die aus dem internen PCR-Fragment abgeleitet wurden, amplifiziert werden. Nach Sequenzierung der PCR-Fragmente und einem Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit Aminosäuresequenzen aus weiteren Organismen wurde eine Homologie von bis zu 95 % festgestellt. Untersuchungen zur Kopienzahl zeigten, daß im Makronukleus das HSP7O-Gen in einer Kopienzahl von 2000-2500 Kopien vorlag. Dies entsprach der durchschnittlichen Kopienzaht von E.crassus. Um Promotor-Elemente zu identifizieren, wurde der Transkriptionsstartpunkt bestimmt. Eine Analyse der 5'-nicht kodierten Region zeigte, daß keine Sequenzhomologie zu den bekannten core-Promotor-Elementen TATA-Box und Initiator-Element bestand. Durch Sequenzvergleiche mit der bekannten Konsensussequenz der Hitze-Schock-Elemente wurden jedoch zwei Hitze-Schock-Elemente identifiziert. Weitere Untersuchungen zur Expression des HSP7O-Gens nach Hitzeschock und ohne Hitzeschock erfolgten sowohl auf der Ebene der RNA als auch auf der Protein-Ebene. Durch eine Northern-Blot-Analyse wurde eine erhöhte Transkripmenge der HSP70-mRNA in hitzeinduzierten Ciliaten festgestellt. Auf der Protein-Ebene zeigte sich jedoch kein quantitativer Unterschied zwischen hitzeinduzierten und nicht hitzeinduzierten Zellen. Inhaltsverzeichnis: 1.|ZUSAMMENFASSUNG|1 2.|EINLEITUNG|2 2.1|Die Genomorganisation des hypotrichen Ciliat Euplotes crassus|2 2.2|Konjugation und Makronukleusentwicklung bei Euplotes crassus|4 2.3|Transk:riptinelle Regulation der Genexpression|5 2.4|Transkriptionelle Regulation d